【關鍵詞】 鉛
鉛是工業應用最廣泛的重金屬之一，在自然界中廣泛存在，居住環境中的生活性鉛污染嚴重危害著人類的健康，尤其是兒童鉛中毒流行比率遠遠高于成人，明顯影響兒童的智力發育。本研究旨在通過觀察慢性醋酸鉛染毒小鼠海馬磷酸化環磷酸腺苷(cAMP)反應成分結合蛋白(pCREB)表達的影響來探討慢性鉛中毒分子機制。
1 材料與方法
11 材料 昆明系小白鼠(中國醫科大學實驗動物部)，雌雄2∶1，體重28～34g。分析純醋酸鉛和硝酸纖維素膜(中國實驗原平皓公司)。十二烷基硫酸鈉(SDS)(華美生物技術公司)。牛血清白蛋白(聯星生物工程公司)。pCREB-抗(美國Cell Signaling公司)。辣根過氧化物酶(HPR)標記的驢抗兔標記的第二抗體(北京中山生物技術有限公司)。低溫離心機F218型(美國Sigma公司)。
12 方法 (1)染毒方法及劑量：按每籠雄∶雌為1∶2自然交配。將受孕母鼠所生小鼠隨機分為4組，每組10只，共40只；對照組和24，48，96mmol/L染鉛組。從小鼠出生第1d起染鉛組母鼠開始通過飲水飼以不同濃度(24，48，96mmol/L)醋酸鉛水溶液。對照組母鼠飲用自來水。為確保相同的營養條件，每個母鼠最多喂養10只胎鼠。斷乳后幼鼠開始自己飲用與其母鼠相同的飲用水。于出生后第14，28，42，56d解剖小鼠取出腦海馬，放入液氮中，轉存到-70℃冰箱中。(2)蛋白免疫印記法：將收集的樣品放到4℃預冷的裂解緩沖液中，4℃超聲混勻(6s，6次)，4℃震蕩60min，離心25000g，60min，取上清分裝。用酚試劑法測蛋白，以牛血清蛋白為標準品。用10%的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分離蛋白質，每孔蛋白加樣量為40μg。常規蛋白免疫印跡法測定pCREB含量。將蛋白印跡顯影圖掃描，再應用Chemi Imager 5500 V203圖像分析軟件對結果進行分析�；叶戎荡砻负�，以不同天數對照組的灰度值為100，其余各組與相應天數的對照組比較。
13 統計分析 采用SPSS 110軟件進行單因素方差分析。
2 結果
21 慢性鉛暴露對小鼠血鉛和腦海馬鉛含量的影響 于小鼠出生后42d對血鉛和腦海馬鉛含量進行測定，各慢性染鉛組小鼠血鉛和腦海馬鉛含量均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜001)，升高的程度與飲用水的鉛濃度呈正相關，見表1。
表1 小鼠血鉛、海馬鉛濃度（略）
注：與對照組比較，a P＜001；與同時期24mmol/L組比較，b P＜001；與同時期48mmol/L組比較，c P＜001
22 蛋白免疫印跡檢測pCREB結果 本實驗所用的一抗具有特異識別CREB的磷酸化Ser133特性，所以實驗的灰度值代表pCREB。將實驗后的電泳圖掃描后，以不同天數對照組的灰度值為100，其余各組與同時期天數的對照組比較。結果發現，除14d低劑量組外，差異均有統計學意義(P＜001)。低劑量組鉛暴露對小鼠pCREB蛋白表達42d前呈現下降趨勢，且只有14d低劑量組略高于對照組。中劑量組鼠pCREB蛋白表達與同時期低劑量組比較只有14d差異有統計學意義(P＜001)。高劑量組鼠pCREB蛋白表達與同時期低劑量組相比較只有14，56d差異有統計學意義(P＜001)。各組pCREB蛋白表達與其自身14d比較差異無統計學意義。中、高劑量組分別在14和42d達谷底，分別下降了4294%和4221%，見表2，圖1。
表2 慢性鉛中毒對pCREB蛋白表達的影響（略）
注：與同時期的對照組比較，a P＜001；與同時期24mmol/L組比較，b P＜001
圖1 Western Blots檢測pCREB結果（略）
3 討論
從無脊椎動物到哺乳類動物，在長時程記憶的編碼方面有共同的分子機制，其中轉錄因子cANP反應元件結合蛋白性氨基酸亮氨酸拉鏈轉錄因子家庭，它有2種形式：具有(CREB)在長時記憶過程中起著關鍵性的作用〔1〕。CREB屬于堿轉錄活性的二聚體和無轉錄活性的單體。其133位的絲氨酸殘基(Ser133)可被蛋白激酶A(PKA)或鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)等磷酸化，磷酸化后的CREB(pCREB)形成同源二聚體或與CREB/ATF(激活轉錄因子1)家庭的其他成員形成異二聚體，使CREB活化，與cAPM的應元件(CRE)結合，調控靶基因(如cfos,cjun等)的轉錄〔2〕。本實驗結果顯示，除14d低劑量組外，各組pCREB均比同時期的對照組低，其他時間點都隨鉛濃度的增加而降低，與我們以前實驗的CaMKⅡ蛋白表達變化規律相似〔3〕，表明其都具有鉛的濃度依賴性降低。根據結果推測，鉛通過抑制海馬N甲基D天冬氨酸(NMDA)等鈣離子通道及其受體，影響胞內鈣離子穩態失衡和CaMKⅡ和N甲基D天冬氨酸受體(NMDAR)的正常結合〔4〕，抑制腺苷酸環化酶〔5〕，影響CaMKⅡ、PKA等的激活狀態，干擾pCREB蛋白活性，cfos，jun基因表達和新蛋白質的合成，導致影響正常的學習記憶功能〔6〕。
【參考文獻】
〔1〕 Frank DA,Greenberg ME.CREB:A mediaton of longterm memory from mollusks to mammals［J］.Cell,1994,79:5-8.
〔2〕 Pietruck C,Xie GX,Sharma M,et al.Multiple splice patterns of cyclic AMP response elementbinding protein mRNA in the central nervous system of the rat［J］.Brain Res Mol Brain Res,1999,69(2):286-289.
〔3〕 文濤，孫黎光，宗志宏，等.慢性鉛暴露對小鼠CaMKⅡ蛋白表達的影響［J］.中國公共衛生，2006，22(10)：1211-1212.
〔4〕 高明奇，孫黎光，周彬，等.慢性鉛暴露小鼠海馬NMDAR亞單位基因表達［J］.中國公共衛生，2006，22(5)：574-575.
〔5〕 阮迪云.鉛對兒童學習記憶的影響及其細胞和分子機理［J］.中國藥理學與毒理學雜志，1997，11(2)：97-98.
〔6〕 文濤，孫黎光，宗志宏，等.鉛對小鼠海馬區cjun表達及學習記憶功能的影響［J］.中國公共衛生，2005，21(2)：183-184.
